#METABOLOMICS WORKBENCH segundocasaro_20230411_044624 DATATRACK_ID:3855 STUDY_ID:ST002556 ANALYSIS_ID:AN004211 VERSION 1 CREATED_ON 04-11-2023 #PROJECT PR:PROJECT_TITLE Blood metabolomics and impacted cellular mechanisms during transition into PR:PROJECT_TITLE lactation in dairy cows that develop metritis PR:PROJECT_TYPE Case-Control Study PR:PROJECT_SUMMARY The objective of this study was to identify metabolites associated with metritis PR:PROJECT_SUMMARY and use them for identification of cellular mechanisms affected during PR:PROJECT_SUMMARY transition into lactation. Holstein cows (n = 104) had blood collected in the PR:PROJECT_SUMMARY prepartum period (d-14 ± 6), at calving (d0), and at the day of metritis PR:PROJECT_SUMMARY diagnosis (d7 ± 2). Cows with reddish or brownish, watery, and fetid discharge PR:PROJECT_SUMMARY were diagnosed with metritis (n = 52). Cows with metritis were paired with PR:PROJECT_SUMMARY herdmates without metritis (n = 52) based on DIM. The metabolome of plasma PR:PROJECT_SUMMARY samples was evaluated using untargeted gas chromatography time-of-flight mass PR:PROJECT_SUMMARY spectrometry. Univariate analyses included t-tests and fold change analyses. PR:PROJECT_SUMMARY Metabolites with false discovery rate (FDR) adjusted P ≤ 0.10 on t-tests were PR:PROJECT_SUMMARY used for partial least squares – discriminant analysis PLS-DA coupled with PR:PROJECT_SUMMARY permutational analysis using 2,000 permutations. Metabolites with FDR adjusted P PR:PROJECT_SUMMARY ≤ 0.10 on t-tests were also used for enriched pathway analyses and PR:PROJECT_SUMMARY identification of cellular processes. Cows that developed metritis had affected PR:PROJECT_SUMMARY cellular processes associated with lower amino acid metabolism in the prepartum PR:PROJECT_SUMMARY period, greater lipolysis, cell death, and oxidative stress at calving and at PR:PROJECT_SUMMARY metritis diagnosis, and greater leukocyte activation at calving, but lower PR:PROJECT_SUMMARY immune cell activation at metritis diagnosis. In summary, cows that developed PR:PROJECT_SUMMARY metritis had plasma metabolomic changes associated with greater lipolysis, PR:PROJECT_SUMMARY oxidative stress, and a dysregulated immune response which may predispose cows PR:PROJECT_SUMMARY to metritis development. PR:INSTITUTE University of Florida PR:DEPARTMENT College of Veterinary Medicine PR:LABORATORY Large Animal Clinical Sciences PR:LAST_NAME Casaro PR:FIRST_NAME Segundo PR:ADDRESS 117 Deriso Hall, 2015 SW 16th Ave. PR:EMAIL segundocasaro@ufl.edu PR:PHONE 3522844016 PR:FUNDING_SOURCE USDA NIFA AFRI PR:DOI http://dx.doi.org/10.21228/M8PF0K #STUDY ST:STUDY_TITLE Blood metabolomics and impacted cellular mechanisms during transition into ST:STUDY_TITLE lactation in dairy cows that develop metritis ST:STUDY_TYPE Case-Control Study ST:STUDY_SUMMARY The objective of this study was to identify metabolites associated with metritis ST:STUDY_SUMMARY and use them for identification of cellular mechanisms affected during ST:STUDY_SUMMARY transition into lactation. Holstein cows (n = 104) had blood collected in the ST:STUDY_SUMMARY prepartum period (d-14 ± 6), at calving (d0), and at the day of metritis ST:STUDY_SUMMARY diagnosis (d7 ± 2). Cows with reddish or brownish, watery, and fetid discharge ST:STUDY_SUMMARY were diagnosed with metritis (n = 52). Cows with metritis were paired with ST:STUDY_SUMMARY herdmates without metritis (n = 52) based on DIM. The metabolome of plasma ST:STUDY_SUMMARY samples was evaluated using untargeted gas chromatography time-of-flight mass ST:STUDY_SUMMARY spectrometry. Univariate analyses included t-tests and fold change analyses. ST:STUDY_SUMMARY Metabolites with false discovery rate (FDR) adjusted P ≤ 0.10 on t-tests were ST:STUDY_SUMMARY used for partial least squares – discriminant analysis PLS-DA coupled with ST:STUDY_SUMMARY permutational analysis using 2,000 permutations. Metabolites with FDR adjusted P ST:STUDY_SUMMARY ≤ 0.10 on t-tests were also used for enriched pathway analyses and ST:STUDY_SUMMARY identification of cellular processes. Cows that developed metritis had affected ST:STUDY_SUMMARY cellular processes associated with lower amino acid metabolism in the prepartum ST:STUDY_SUMMARY period, greater lipolysis, cell death, and oxidative stress at calving and at ST:STUDY_SUMMARY metritis diagnosis, and greater leukocyte activation at calving, but lower ST:STUDY_SUMMARY immune cell activation at metritis diagnosis. In summary, cows that developed ST:STUDY_SUMMARY metritis had plasma metabolomic changes associated with greater lipolysis, ST:STUDY_SUMMARY oxidative stress, and a dysregulated immune response which may predispose cows ST:STUDY_SUMMARY to metritis development. ST:INSTITUTE University of Florida ST:DEPARTMENT College of Veterinary Medicine ST:LABORATORY Large Animal Clinical Sciences ST:LAST_NAME segundocasaro ST:FIRST_NAME Segundo ST:ADDRESS 117 Deriso Hall, 2015 SW 16th Ave. ST:EMAIL segundocasaro@ufl.edu ST:PHONE 3522844016 ST:SUBMIT_DATE 2023-04-11 #SUBJECT SU:SUBJECT_TYPE Mammal SU:SUBJECT_SPECIES Bos taurus SU:TAXONOMY_ID 9913 SU:WEIGHT_OR_WEIGHT_RANGE 700 kg SU:GENDER Female SU:ANIMAL_HOUSING Free-stalls SU:ANIMAL_FEED TMR #SUBJECT_SAMPLE_FACTORS: SUBJECT(optional)[tab]SAMPLE[tab]FACTORS(NAME:VALUE pairs separated by |)[tab]Additional sample data SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10001 10001_Calving_Con Group:Con | Time:Calving | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10038 10038_Calving_Con Group:Con | Time:Calving | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9268 9268_Calving_Con Group:Con | Time:Calving | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9280 9280_Calving_Con Group:Con | Time:Calving | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9509 9509_Calving_Con Group:Con | 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Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10263 10263_Calving_Met Group:Met | Time:Calving | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10267 10267_Calving_Met Group:Met | Time:Calving | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10278 10278_Calving_Met Group:Met | Time:Calving | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10293 10293_Calving_Met Group:Met | Time:Calving | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10294 10294_Calving_Met Group:Met | Time:Calving | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10298 10298_Calving_Met Group:Met | Time:Calving | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10304 10304_Calving_Met Group:Met | Time:Calving | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10308 10308_Calving_Met Group:Met | Time:Calving | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10318 10318_Calving_Met Group:Met | Time:Calving | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10004 10004_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 8790 8790_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9193 9193_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9206 9206_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9221 9221_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9232 9232_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9292 9292_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9481 9481_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9490 9490_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9505 9505_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9669 9669_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9796 9796_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9810 9810_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9832 9832_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9848 9848_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9908 9908_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9910 9910_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9977 9977_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9980 9980_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10156 10156_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10158 10158_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10175 10175_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10193 10193_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10198 10198_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10206 10206_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10207 10207_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10208 10208_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10213 10213_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10215 10215_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10219 10219_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10222 10222_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10223 10223_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10230 10230_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10231 10231_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10239 10239_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10249 10249_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10251 10251_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10253 10253_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10256 10256_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10257 10257_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10258 10258_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10259 10259_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10260 10260_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10263 10263_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10267 10267_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10278 10278_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10293 10293_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10294 10294_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10298 10298_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10304 10304_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10308 10308_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10318 10318_Diagnosis_Met Group:Met | Time:Diagnosis | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10004 10004_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 8790 8790_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9193 9193_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9206 9206_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9221 9221_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9232 9232_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9292 9292_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9481 9481_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9490 9490_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9505 9505_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9669 9669_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9796 9796_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9810 9810_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9832 9832_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9848 9848_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9908 9908_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9910 9910_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9977 9977_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 9980 9980_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Mult SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10156 10156_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10158 10158_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10175 10175_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10193 10193_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10198 10198_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10206 10206_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10207 10207_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10208 10208_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10213 10213_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10215 10215_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10219 10219_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10222 10222_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10223 10223_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10230 10230_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10231 10231_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10239 10239_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10249 10249_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10251 10251_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10253 10253_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10256 10256_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10257 10257_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10258 10258_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10259 10259_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10260 10260_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10263 10263_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10267 10267_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10278 10278_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10293 10293_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10294 10294_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10298 10298_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10304 10304_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10308 10308_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 10318 10318_Prepartum_Met Group:Met | Time:Prepartum | Parity:Prim #COLLECTION CO:COLLECTION_SUMMARY All cows had blood collected in the prepartum period (-14 DRP), calving (first CO:COLLECTION_SUMMARY 24h after calving), and at diagnosis (day of metritis diagnosis). Blood was CO:COLLECTION_SUMMARY sampled from the jugular vein using a 20-gauge x 2.54-cm needle and 10-mL CO:COLLECTION_SUMMARY evacuated tube containing lithium heparin (Vacutainer, Becton, Dickinson and CO:COLLECTION_SUMMARY Company, Franklin Lakes, NJ, USA). After collection, the blood tubes were placed CO:COLLECTION_SUMMARY on ice and transported to the laboratory within 2 hours. Once in the laboratory, CO:COLLECTION_SUMMARY the blood tubes were centrifuged at 4000 g, 4 °C, for 10 min, and the CO:COLLECTION_SUMMARY plasma was stored at -80 oC for further characterization of the plasma CO:COLLECTION_SUMMARY metabolome. The frozen plasma was submitted to the University of California’s CO:COLLECTION_SUMMARY West Coast Metabolomics Center in Davis, CA for metabolome analysis. Samples CO:COLLECTION_SUMMARY were analyzed by blinded technicians using untargeted gas chromatography with CO:COLLECTION_SUMMARY time-of-flight mass spectrometry (GC-TOF-MS) in a single batch. CO:SAMPLE_TYPE Blood (plasma) #TREATMENT TR:TREATMENT_SUMMARY This was a case-control study, hence, there were not treatments applied. Cows TR:TREATMENT_SUMMARY were self assigned to the groups. Cows that developed metritis were paired with TR:TREATMENT_SUMMARY healthy cows by days in milk. #SAMPLEPREP SP:SAMPLEPREP_SUMMARY After collection, the blood tubes were placed on ice and transported to the SP:SAMPLEPREP_SUMMARY laboratory within 2 hours. Once in the laboratory, the blood tubes were SP:SAMPLEPREP_SUMMARY centrifuged at 4000 g, 4 °C, for 10 min, and the plasma was stored at -80 SP:SAMPLEPREP_SUMMARY oC for further characterization of the plasma metabolome. The frozen plasma was SP:SAMPLEPREP_SUMMARY submitted to the University of California’s West Coast Metabolomics Center in SP:SAMPLEPREP_SUMMARY Davis, CA for metabolome analysis #CHROMATOGRAPHY CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY Data are acquired using the following chromatographic parameters, with more CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY details to be found in Fiehn O. et al. Plant J. 53 (2008) 691–704. Column: CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY Restek corporation Rtx-5Sil MS (30 m length x 0.25 mm internal diameter with CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY 0.25 μm film made of 95% dimethyl/5%diphenylpolysiloxane) Mobile phase: Helium CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY Column temperature: 50-330°C Flow- rate: 1 mL min-1 Injection volume: 0.5 μL CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY Injection: 25 splitless time into a multi-baffled glass liner Injection CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY temperature: 50°C ramped to 250°C by 12°C s-1 Oven temperature program: 50°C CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY for 1 min, then ramped at 20°C min-1 to 330°C, held constant for 5 min. The CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY analytical GC column is protected by a 10 m long empty guard column which is cut CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY by 20 cm intervals whenever the reference mixture QC samples indicate problems CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY caused by column contaminations. We have validated that at this sequence of CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY column cuts, no detrimental effects are detected with respect to peak shapes, CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY absolute or relative metabolite retention times or reproducibility of CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY quantifications. This chromatography method yields excellent retention and CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY separation of primary metabolite classes (amino acids, hydroxyl acids, CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY carbohydrates, sugar acids, sterols, aromatics, nucleosides, amines and CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY miscellaneous compounds) with narrow peak widths of 2–3 s and very good CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY within-series retention time reproducibility of better than 0.2 s absolute CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY deviation of retention times. We use automatic liner exchanges after each set of CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY 10 injections which we could show to reduce sample carryover for highly CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY lipophilic compounds such as free fatty acids. Mass spectrometry parameters are CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY used as follows: a Leco Pegasus IV mass spectrometer is used with unit mass CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY resolution at 17 spectra s-1 from 80-500 Da at - 70 eV ionization energy and CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY 1800 V detector voltage with a 230°C transfer line and a 250°C ion source. CH:INSTRUMENT_NAME Leco Pegasus IV GC CH:COLUMN_NAME Restek Rtx-5Sil MS (30m x 0.25mm, 0.25um) CH:COLUMN_TEMPERATURE 50-330 CH:FLOW_GRADIENT . CH:FLOW_RATE 1 mL min-1 CH:SOLVENT_A . CH:SOLVENT_B . CH:CHROMATOGRAPHY_TYPE GC #ANALYSIS AN:ANALYSIS_TYPE MS AN:ANALYSIS_PROTOCOL_FILE Methods_SC.pdf #MS MS:INSTRUMENT_NAME Leco Pegasus IV TOF MS:INSTRUMENT_TYPE GC-TOF MS:MS_TYPE Other MS:MS_COMMENTS See data acquisition, processing, and reporting in "Methods.pdf" file MS:ION_MODE POSITIVE #MS_METABOLITE_DATA MS_METABOLITE_DATA:UNITS peak heights MS_METABOLITE_DATA_START Samples 10001_Calving_Con 10038_Calving_Con 9268_Calving_Con 9280_Calving_Con 9509_Calving_Con 9536_Calving_Con 9778_Calving_Con 9794_Calving_Con 9802_Calving_Con 9804_Calving_Con 9823_Calving_Con 9872_Calving_Con 9875_Calving_Con 9876_Calving_Con 9904_Calving_Con 9907_Calving_Con 9917_Calving_Con 9918_Calving_Con 9924_Calving_Con 9925_Calving_Con 9927_Calving_Con 9942_Calving_Con 9944_Calving_Con 9945_Calving_Con 9950_Calving_Con 9954_Calving_Con 9956_Calving_Con 9957_Calving_Con 9966_Calving_Con 9971_Calving_Con 9979_Calving_Con 9985_Calving_Con 9987_Calving_Con 9992_Calving_Con 10165_Calving_Con 10171_Calving_Con 10189_Calving_Con 10194_Calving_Con 10199_Calving_Con 10212_Calving_Con 10229_Calving_Con 10245_Calving_Con 10246_Calving_Con 10254_Calving_Con 10261_Calving_Con 10262_Calving_Con 10264_Calving_Con 10268_Calving_Con 10274_Calving_Con 10290_Calving_Con 10303_Calving_Con 10311_Calving_Con 10001_Diagnosis_Con 10038_Diagnosis_Con 9268_Diagnosis_Con 9280_Diagnosis_Con 9509_Diagnosis_Con 9536_Diagnosis_Con 9778_Diagnosis_Con 9794_Diagnosis_Con 9802_Diagnosis_Con 9804_Diagnosis_Con 9823_Diagnosis_Con 9872_Diagnosis_Con 9875_Diagnosis_Con 9876_Diagnosis_Con 9904_Diagnosis_Con 9907_Diagnosis_Con 9917_Diagnosis_Con 9918_Diagnosis_Con 9924_Diagnosis_Con 9925_Diagnosis_Con 9927_Diagnosis_Con 9942_Diagnosis_Con 9944_Diagnosis_Con 9945_Diagnosis_Con 9950_Diagnosis_Con 9954_Diagnosis_Con 9956_Diagnosis_Con 9957_Diagnosis_Con 9966_Diagnosis_Con 9971_Diagnosis_Con 9979_Diagnosis_Con 9985_Diagnosis_Con 9987_Diagnosis_Con 9992_Diagnosis_Con 10165_Diagnosis_Con 10171_Diagnosis_Con 10189_Diagnosis_Con 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486724 254 dehydroabietic acid 94391 C12078 849349 239 deoxycholic acid 222528 C04483 1106875 255 D-erythro-sphingosine 5280335 C00319 859500 204 dihydroxyacetone 670 C00184 332120 89 docosahexaenoic acid 445580 C06429 902819 91 elaidic acid 637517 C01712 784781 129 epsilon-caprolactam 7768 C06593 353069 170 erythritol 222285 C00503 471922 217 erythrose 439574 C01796 443306 205 ethanolamine 700 C00189 344719 174 ethanol phosphate 74190 . 317291 211 fructose 439709 C02336 639442 307 fructose-1-phosphate 439394 C01094 803180 387 fructose-6-phosphate 440641 C05345 804750 315 fucose 439650 C02095 578299 160 fumaric acid 444972 C00122 390775 245 galactinol 11727586 C01235 1017580 204 galactose-6-phosphate 439404 C01113 828102 387 gluconic acid 6857417 C00800 693148 333 glucose 64689 C00221 659798 319 glucose-1-phosphate 65533 C00103 594647 217 glucose-6-phosphate 5958 C00092 818275 387 glutamic acid 33032 C00025 529100 246 glutamine 5961 C00064 600315 156 glutaric acid 743 C00489 421596 261 glyceric acid 439194 C00258 377495 189 glycerol 753 C00116 344466 205 glycerol-3-galactoside 16048618 C05401 800205 204 glycerol-alpha-phosphate 754 C03189 590747 357 glycine 750 C00037 368707 248 glycocyamine 763 C00581 511016 171 glycolic acid 757 C00160 227636 177 glycyl-proline 3013625 . 691662 174 glycyl tyrosine 92829 . 922071 174 guanine 764 C00242 744307 352 guanosine 6802 C00387 957445 324 heptadecanoic acid 10465 . 751309 117 hippuric acid 464 C01586 637236 206 histidine 6274 C00135 663102 154 homoserine 12647 C00263 443878 218 hydrocinnamic acid 107 C05629 434422 104 hydroxycarbamate 16639161 . 325318 278 hypoxanthine 790 C00262 619128 265 ile-ile . 677904 158 indole-3-acetate 802 C00954 684929 202 indole-3-lactate . 764079 202 indole-3-propionic acid 3744 . 732249 202 indoxyl sulfate 10258 . 577333 277 inosine 6021 C00294 897434 230 inositol-4-monophosphate 440043 C03546 845976 315 isocitric acid 5318532 C00451 617338 245 isoheptadecanoic acid 164860 . 737927 117 isoleucine 6306 C00407 359251 158 isolinoleic acid 5312483 . 794629 156 isopentadecanoic acid 151014 . 663518 117 isoribose 10975657 . 558730 217 isothreonic acid 151152 C00639 489385 292 itaconic acid 811 C00490 386511 147 kynurenine 25245862 C01718 769709 218 lactamide 94220 . 265698 232 lactic acid 612 C01432 217657 191 lactitol 157355 C13542 959541 361 lactobionic acid 7314 C04247 972139 204 lactose 6134 C01970 936998 204 lanosterol 246983 C01724 1129573 393 lauric acid 3893 C02679 547906 117 leucine 6106 C00123 345845 158 lignoceric acid 11197 C08320 978597 132 linoleic acid 5280450 C01595 777414 150 lithocholic acid 9903 C03990 1104161 215 lysine 5962 C00047 663483 317 lyxitol 439255 C00532 573587 217 lyxose 439240 C00476 541086 217 maleimide 10935 C07272 245118 154 malic acid 525 C00711 463180 233 malonic acid 867 C00383 305372 233 maltose 439186 C00208 946601 204 maltotriose 439586 C01835 1176044 361 mannose 18950 C00159 645856 205 mannose-6-phosphate 65127 C00275 822643 387 melibiose 440658 C05402 988497 361 methanolphosphate 13130 . 289520 241 methionine 6137 C00073 483560 176 methionine sulfoxide 158980 C02989 637588 128 methylmaleic acid 643798 C02226 418804 259 Mevalonic acid . 498785 247 myo-inositol 892 C00137 730022 305 myristic acid 11005 C06424 634414 285 N-acetylaspartic acid 65065 C01042 548028 158 N-acetyl-D-galactosamine 440552 C05021 720730 319 N-acetylglycine 10972 . 356109 174 N-acetylmannosamine 439281 C00645 735323 319 N-acetylornithine 439232 C00437 682693 174 N-carbamoylaspartate 93072 C00438 611345 257 n-epsilon-trimethyllysine 440121 . 512366 118 nicotinamide 936 C00153 471602 179 nicotinic acid 938 C00253 366992 180 nonadecanoic acid 12591 C16535 822782 117 norvaline 65098 C01826 326715 144 O-acetylserine 99478 C00979 414914 174 octadecanol 8221 . 755409 327 octadecylglycerol 3681 C13858 928878 205 oleamide 5283387 C19670 849710 144 oleic acid 445639 C00712 781527 339 O-phosphoserine 57689797 C01005 624355 356 ornithine 6262 C00077 527113 142 orotic acid 967 C00295 586317 254 oxalic acid 971 C00209 260513 190 oxoproline 7405 C01879 485935 156 palmitic acid 985 C00249 713809 313 palmitoleic acid 445638 C08362 706508 311 pantothenic acid 6613 C12276 690887 291 parabanic acid 67126 C00802 464991 100 pentadecanoic acid 13849 C16537 674647 117 pentitol 827 D00061 563801 307 phenaceturic acid 68144 C05598 654351 91 phenylacetic acid 999 C07086 368081 164 phenylalanine 6140 C00079 537804 192 phenylethylamine 1001 C05332 510327 174 phosphate 1004 C00009 348274 314 phosphoenolpyruvate 58114173 C00074 518184 211 phosphoethanolamine 1015 C00346 604335 299 p-hydroxylphenyllactic acid 9378 C03672 654036 308 phytanic acid 10380830 . 770604 159 pimelic acid 385 C02656 523205 155 pipecolinic acid 6931662 . 404121 156 piperidone 12665 . 275603 156 proline 145742 C00148 364716 142 pseudo uridine 15047 C02067 813899 217 p-tolyl glucuronide 154035 . 847531 180 putrescine 1045 C00138 588119 174 pyrophosphate 1023 C00013 327517 110 pyrrole-2-carboxylic acid 12473 C05942 394886 240 pyruvic acid 1060 C00022 211668 174 quinolinic acid 1066 C03722 581638 296 ribitol 827 C00474 575497 217 ribonic acid 5460677 C01685 597646 292 ribose 5779 C00121 553135 217 ribose-5-phosphate 439167 C00117 731837 315 ribulose-5-phosphate 439184 C00199 735908 357 saccharic acid 33037 C00818 699211 333 sarcosine 7311726 C00213 266344 116 serine 5951 C00065 395020 204 serotonin 5202 C00780 863824 174 shikimic acid 8742 C00493 611100 204 sophorose 441432 C08250 962064 307 sorbitol 5780 C00794 667922 217 spermidine 1102 C00315 792924 144 squalene 638072 C00751 976237 95 stearic acid 5281 C01530 787622 117 succinate semialdehyde 1112 C00232 297024 113 succinic acid 1110 C00042 370608 247 sucrose 5988 C00089 915139 271 tagatose 439312 C00795 631835 307 taurine 1123 C00245 556690 326 threitol 169019 C16884 467595 217 threonic acid 5460407 C01620 497572 292 threonine 6288 C00188 409568 218 thymidine 5789 C00214 349402 170 thymine 1135 C00178 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