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"PROJECT":{"PROJECT_TITLE":"Biomarkers of NAFLD progression: a lipidomics approach to an epidemic","PROJECT_TYPE":"Lipidomics Study","PROJECT_SUMMARY":"The spectrum of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) includes steatosis, nonalcoholic steatohepatitis (NASH), and cirrhosis. Recognition and timely diagnosis of these different stages, particularly NASH, is important for both potential reversibility and limitation of complications. Liver biopsy remains the clinical standard for definitive diagnosis. Diagnostic tools minimizing the need for invasive procedures or that add information to histologic data are important in novel management strategies for the growing epidemic of NAFLD. We describe an 'omics' approach to detecting a reproducible signature of lipid metabolites, aqueous intracellular metabolites, SNPs, and mRNA transcripts in a double-blinded study of patients with different stages of NAFLD that involves profiling liver biopsies, plasma, and urine samples. Using linear discriminant analysis, a panel of 20 plasma metabolites that includes glycerophospholipids, sphingolipids, sterols, and various aqueous small molecular weight components involved in cellular metabolic pathways, can be used to differentiate between NASH and steatosis. This identification of differential biomolecular signatures has the potential to improve clinical diagnosis and facilitate therapeutic intervention of NAFLD.","INSTITUTE":"University of California, San Diego","DEPARTMENT":"Bioengineering","LAST_NAME":"Fahy","FIRST_NAME":"Eoin","ADDRESS":"9500 Gilman, La Jolla, CA, 92093, USA","EMAIL":"efahy@ucsd.edu","PHONE":"858-534-4076","FUNDING_SOURCE":"NIGMS Grant GM U54069338","PUBLICATIONS":"https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4340319/","CONTRIBUTORS":"LIPID MAPS Consortium"},

"STUDY":{"STUDY_TITLE":"Biomarkers of NAFLD progression: a lipidomics approach to an epidemic. Part 3:Urine","STUDY_TYPE":"Lipidomics Study","STUDY_SUMMARY":"The spectrum of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) includes steatosis, nonalcoholic steatohepatitis (NASH), and cirrhosis. Recognition and timely diagnosis of these different stages, particularly NASH, is important for both potential reversibility and limitation of complications. Liver biopsy remains the clinical standard for definitive diagnosis. Diagnostic tools minimizing the need for invasive procedures or that add information to histologic data are important in novel management strategies for the growing epidemic of NAFLD. We describe an 'omics' approach to detecting a reproducible signature of lipid metabolites, aqueous intracellular metabolites, SNPs, and mRNA transcripts in a double-blinded study of patients with different stages of NAFLD that involves profiling liver biopsies, plasma, and urine samples. Using linear discriminant analysis, a panel of 20 plasma metabolites that includes glycerophospholipids, sphingolipids, sterols, and various aqueous small molecular weight components involved in cellular metabolic pathways, can be used to differentiate between NASH and steatosis. This identification of differential biomolecular signatures has the potential to improve clinical diagnosis and facilitate therapeutic intervention of NAFLD.","INSTITUTE":"University of California, San Diego","DEPARTMENT":"Bioengineering","LAST_NAME":"Fahy","FIRST_NAME":"Eoin","ADDRESS":"9500 Gilman, La Jolla, CA, 92093, USA","EMAIL":"efahy@ucsd.edu","PHONE":"858-534-4076","PUBLICATIONS":"https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4340319/"},

"SUBJECT":{"SUBJECT_TYPE":"Human clinical study","SUBJECT_SPECIES":"Homo sapiens","TAXONOMY_ID":"9606","AGE_OR_AGE_RANGE":"23-83","GENDER":"Male and Female","HUMAN_ETHNICITY":"Black/White"},
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"Subject ID":"-",
"Sample ID":"NASH062",
"Factors":{"Diagnosis":"Steatosis"},
"Additional sample data":{"GENDER":"F","BMI":"56.6","ETHNICITY":"White","AGE":"51","AST":"15","ALT":"16","ALKP":"58","TBIL":"0.5","GLUCOSE":"90"}
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"Subject ID":"-",
"Sample ID":"NASH071",
"Factors":{"Diagnosis":"Steatosis"},
"Additional sample data":{"GENDER":"F","BMI":"40","ETHNICITY":"White","AGE":"33","AST":"15","ALT":"12","ALKP":"59","TBIL":"0.4","GLUCOSE":"85"}
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"Sample ID":"NASH073",
"Factors":{"Diagnosis":"Steatosis"},
"Additional sample data":{"GENDER":"F","BMI":"80.2","ETHNICITY":"Black","AGE":"34","AST":"11","ALT":"11","ALKP":"90","TBIL":"0.4","GLUCOSE":"163"}
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"Sample ID":"NASH075",
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"Additional sample data":{"GENDER":"M","BMI":"33","ETHNICITY":"White","AGE":"67","AST":"22","ALT":"34","ALKP":"96","TBIL":"0.5","GLUCOSE":"191"}
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"Sample ID":"NASH076",
"Factors":{"Diagnosis":"Steatosis"},
"Additional sample data":{"GENDER":"F","BMI":"50","ETHNICITY":"White","AGE":"51","AST":"-","ALT":"-","ALKP":"-","TBIL":"-","GLUCOSE":"92"}
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"Sample ID":"NASH079",
"Factors":{"Diagnosis":"Steatosis"},
"Additional sample data":{"GENDER":"F","BMI":"43","ETHNICITY":"White","AGE":"37","AST":"-","ALT":"-","ALKP":"-","TBIL":"-","GLUCOSE":"85"}
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"Sample ID":"NASH081",
"Factors":{"Diagnosis":"Steatosis"},
"Additional sample data":{"GENDER":"F","BMI":"46","ETHNICITY":"White","AGE":"65","AST":"-","ALT":"-","ALKP":"-","TBIL":"-","GLUCOSE":"119"}
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"Sample ID":"NASH083",
"Factors":{"Diagnosis":"Steatosis"},
"Additional sample data":{"GENDER":"M","BMI":"39","ETHNICITY":"White","AGE":"41","AST":"-","ALT":"-","ALKP":"-","TBIL":"-","GLUCOSE":"106"}
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"COLLECTION":{"COLLECTION_SUMMARY":"Human samples were collected according to a protocol approved by Vanderbilt University Medical Center's Internal Review Board (#120829) and under informed written patients' consent prior to inclusion in this study. Sample sizes were selected to minimize the invasive procedures. Plasma samples were obtained from patients' blood collected during standard of care surgical procedures. Urine samples were collected from patients' Foley catheters placed for standard of care procedure. Liver samples were obtained from the excess tissue collected as part of the standard of care liver biopsies performed at the time of surgery that would otherwise be discarded. Subsequently, studies at University of California, San Diego were conducted under further auspices of University of California, San Diego Internal Review Board #121220.","SAMPLE_TYPE":"Urine"},

"TREATMENT":{"TREATMENT_SUMMARY":"-"},

"SAMPLEPREP":{"SAMPLEPREP_SUMMARY":"Urine sample extraction. Five hundred microliters of thawed urine containing 4 µl of internal standard mix were extracted with 500 µl cold (-20°C) CH3OH by incubation in an ice bath for 30 min. After mixing by vortex at 4°C for 1 min and centrifugation (4°C, 18,000 g, 10 min), the solvent was evaporated from the supernatant and the residue was dissolved in 400 µl of resuspension solvent, vortexed to mix (1 min at 4°C), and centrifuged (4°C, 18,000 g, 10 min) to remove any insoluble material. GPLs: GPLs from liver samples were extracted and analyzed by MS essentially as described in (20, 21). Extraction and analysis of plasma samples was according to previously published procedures (22). Cardiolipin, coenzyme Q, and dolichol: Lipid extractions were performed based on the Bligh and Dyer method with minor modifications (23-25). FAs and eicosanoids: FFAs were extracted essentially as previously described after supplementation with deuterated internal standards (Cayman Chemicals) (26, 27). Eicosanoids were isolated via solid phase extraction, utilizing 25 deuterated internal standards (28, 29). Sterols and oxysterols: Sterols and oxysterols were extracted using previously described methods (30). Neutral lipids: Cholesteryl esters (CEs), TAGs, and DAGs were extracted from weighed liver tissue (0.5-1 mg) suspended in 0.5 ml PBS that had been homogenized by sonication. Extractions of plasma (0.05 ml diluted to 0.1 ml with PBS), urine (1 ml), and tissue sonicates were carried out using 1 ml hexane:methyl t-butyl ether (1:1, v/v), essentially as previously described (31). Sphingolipids: Sphingolipids from liver, plasma, and urine were extracted following previously published procedures (32, 33), with the exception that methylene chloride was substituted for chloroform for the single-phase extraction of sphingoid bases. 20. Ivanova P. T., Milne S. B., Byrne M. O., Xiang Y., Brown H. A. 2007. Glycerophospholipid identification and quantitation by electrospray ionization mass spectrometry. Methods Enzymol. 432: 21-57.  21. Myers D. S., Ivanova P. T., Milne S. B., Brown H. A. 2011. Quantitative analysis of glycerophospholipids by LC-MS: acquisition, data handling, and interpretation. Biochim. Biophys. Acta. 1811: 748-757.  22. Quehenberger O., Armando A. M., Brown H. A., Milne S. B., Myers D. S., Merrill A. H., Jr, Bandyopadhyay S., Jones K. N., Kelly S., Shaner R. L., et al. 2010. Lipidomics reveals a remarkable diversity of lipids in human plasma. J. Lipid Res. 51: 3299-3305.  23. Guan Z., Li S., Smith D., Shaw W., Raetz C. 2007. Identification of N-acylphosphatidylserine molecules in eukaryotic cells. Biochemistry. 46: 14500-14513.  24. Tan B. K., Bogdanov M., Zhao J., Dowhan W., Raetz C. R., Guan Z. 2012. Discovery of cardiolipin synthase utilizing phosphatidylethanolamine and phosphatidylglycerol as substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109: 16504-16509.  25. Wen R., Lam B., Guan Z. 2013. Aberrant dolichol chain lengths as biomarkers for retinitis pigmentosa caused by impaired dolichol biosynthesis. J. Lipid Res. 54: 3516-3522.  26. Quehenberger O., Armando A., Dumlao D., Stephens D. L., Dennis E. A. 2008. Lipidomics analysis of essential fatty acids in macrophages. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 79: 123-129.  27. Quehenberger O., Armando A. M., Dennis E. A. 2011. High sensitivity quantitative lipidomics analysis of fatty acids in biological samples by gas chromatography-mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta. 1811: 648-656.  28. Deems R., Buczynski M. W., Bowers-Gentry R., Harkewicz R., Dennis E. A. 2007. Detection and quantitation of eicosanoids via high performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. Methods Enzymol. 432: 59-82.  29. Dumlao D. S., Buczynski M. W., Norris P. C., Harkewicz R., Dennis E. A. 2011. High-throughput lipidomic analysis of fatty acid derived eicosanoids and N-acylethanolamines. Biochim. Biophys. Acta. 1811: 724-736.  30. McDonald J. G., Smith D. D., Stiles A. R., Russell D. W. 2012. A comprehensive method for extraction and quantitative analysis of sterols and secosteroids from human plasma. J. Lipid Res. 53: 1399-1409.  31. Hutchins P. M., Barkley R. M., Murphy R. C. 2008. Separation of cellular nonpolar neutral lipids by normal-phase chromatography and analysis by electrospray ionization mass spectrometry. J. Lipid Res. 49: 804-813. 32. Shaner R. L., Allegood J. C., Park H., Wang E., Kelly S., Haynes C. A., Sullards M. C., Merrill A. H., Jr 2009. Quantitative analysis of sphingolipids for lipidomics using triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometers. J. Lipid Res. 50: 1692-1707.  33. Sullards M. C., Liu Y., Chen Y., Merrill A. H., Jr 2011. Analysis of mammalian sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and tissue imaging mass spectrometry (TIMS). Biochim. Biophys. Acta. 1811: 838-853."},

"CHROMATOGRAPHY":{"CHROMATOGRAPHY_SUMMARY":"The organic solvent extraction layer containing CEs, TAGs, and DAGs was taken to dryness, then derivatized with 2,5-difluorophenylisocyanate to convert DAGs to urethane derivatives (35). The derivatized extract was separated by normal phase LC as previously described (35). The CEs eluting first from the LC column were detected by 20 specific MRM transitions corresponding to each [M+NH4]+ ion being collisionally activated to m/z 369.3. During elution of TAGs, the mass spectrometer was set to carry out full mass scanning from m/z 400-1,000. The DAGs were detected by neutral loss scanning of 190 Da. 35. Leiker T. J., Barkley R. M., Murphy R. C. 2011. Analysis of diacylglycerol molecular species in cellular lipid extracts by normal-phase LC-electrospray mass spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 305: 103-109","INSTRUMENT_NAME":"Multiple","COLUMN_NAME":"Multiple","CHROMATOGRAPHY_TYPE":"Core E"},

"ANALYSIS":{"ANALYSIS_TYPE":"MS"},

"MS":{"MS_COMMENTS":"-","INSTRUMENT_NAME":"-","INSTRUMENT_TYPE":"-","MS_TYPE":"Other","ION_MODE":"UNSPECIFIED"},

"MS_METABOLITE_DATA":{
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