#METABOLOMICS WORKBENCH Masatomo_Takahashi_20230525_050334 DATATRACK_ID:4042 STUDY_ID:ST002729 ANALYSIS_ID:AN004426 VERSION 1 CREATED_ON 11-09-2023 #PROJECT PR:PROJECT_TITLE Role of AICARP, an endogenous AMPK activator, in improved endurance capacity in PR:PROJECT_TITLE diabetic mice during SGLT2 inhibition. PR:PROJECT_TYPE Wide targeted metabolomics & lipidomics PR:PROJECT_SUMMARY Diabetes is often associated with increased risk of deleterious muscle mass and PR:PROJECT_SUMMARY function or sarcopenia, thus leading to physical inactivity and metabolic PR:PROJECT_SUMMARY disorders. Sodium-glucose cotransporter 2 (SGLT2) inhibitors are an oral PR:PROJECT_SUMMARY antidiabetic drug that promotes urinary excretion of glucose in the renal PR:PROJECT_SUMMARY proximal tubules. However, how SGLT2 inhibition affects the skeletal muscle PR:PROJECT_SUMMARY function in patients with diabetes remains elusive. Here, we examined the PR:PROJECT_SUMMARY differential effect of CANA on the oxidative soleus and glycolytic EDL muscles PR:PROJECT_SUMMARY from genetically obese diabetic db/db mice. PR:INSTITUTE Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University PR:DEPARTMENT Metabolomics PR:LABORATORY Bamba lab. PR:LAST_NAME Takahashi PR:FIRST_NAME Masatomo PR:ADDRESS Maidashi 3-1-1, Higashi-ku, Fukuoka, Fukuoka, 8128582, Japan PR:EMAIL m-takahashi@bioreg.kyushu-u.ac.jp PR:PHONE 0926426171 PR:PUBLICATIONS https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jcsm.13350 PR:DOI http://dx.doi.org/10.21228/M8VT66 #STUDY ST:STUDY_TITLE Improved Endurance Capacity of Diabetic Mice during SGLT2 Inhibition: Potential ST:STUDY_TITLE Role of AICARP, an Endogenous AMPK Activator. ST:STUDY_SUMMARY Diabetes is associated with an increased risk of deleterious changes in muscle ST:STUDY_SUMMARY mass and function or sarcopenia, leading to physical inactivity and worsening ST:STUDY_SUMMARY glycemic control. Given the negative energy balance during sodium-glucose ST:STUDY_SUMMARY cotransporter 2 (SGLT2) inhibition, whether SGLT2 inhibitors affect skeletal ST:STUDY_SUMMARY muscle mass and function is a matter of concern. However, how SGLT2 inhibition ST:STUDY_SUMMARY affects the skeletal muscle function in patients with diabetes remains ST:STUDY_SUMMARY insufficiently explored. We aimed to explore the effects of canagliflozin ST:STUDY_SUMMARY (CANA), an SGLT2 inhibitor, on skeletal muscles in genetically diabetic db/db ST:STUDY_SUMMARY mice. ST:INSTITUTE Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University ST:LAST_NAME Takahashi ST:FIRST_NAME Masatomo ST:ADDRESS Maidashi 3-1-1, Higashi-ku, Fukuoka, Fukuoka, 8128582, Japan ST:EMAIL m-takahashi@bioreg.kyushu-u.ac.jp ST:PHONE 0926426171 ST:SUBMIT_DATE 2023-05-25 #SUBJECT SU:SUBJECT_TYPE Mammal SU:SUBJECT_SPECIES Mus musculus SU:TAXONOMY_ID 10090 #SUBJECT_SAMPLE_FACTORS: SUBJECT(optional)[tab]SAMPLE[tab]FACTORS(NAME:VALUE pairs separated by |)[tab]Additional sample data SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 13 Animal:db/db | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=13 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 14 Animal:db/db | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=14 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 15 Animal:db/db | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=15 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 16 Animal:db/db | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=16 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 61 Animal:db/db | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=61 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 62 Animal:db/db | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=62 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 63 Animal:db/db | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=63 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 64 Animal:db/db | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=64 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 10 Animal:db/db | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=10 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 11 Animal:db/db | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=11 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 12 Animal:db/db | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=12 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 57 Animal:db/db | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=57 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 58 Animal:db/db | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=58 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 59 Animal:db/db | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=59 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 60 Animal:db/db | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=60 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 9 Animal:db/db | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=9 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 21 Animal:db/+ | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=21 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 22 Animal:db/+ | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=22 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 23 Animal:db/+ | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=23 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 24 Animal:db/+ | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=24 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 5 Animal:db/+ | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=5 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 6 Animal:db/+ | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=6 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 7 Animal:db/+ | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=7 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 8 Animal:db/+ | Treatment:Cana RAW_FILE_NAME=8 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 1 Animal:db/+ | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=1 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 17 Animal:db/+ | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=17 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 18 Animal:db/+ | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=18 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 19 Animal:db/+ | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=19 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 2 Animal:db/+ | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=2 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 20 Animal:db/+ | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=20 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 3 Animal:db/+ | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=3 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 4 Animal:db/+ | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=4 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 49 Animal:db/+ | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=49 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 50 Animal:db/+ | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=50 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 51 Animal:db/+ | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=51 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 52 Animal:db/+ | Treatment:vehicle RAW_FILE_NAME=52 #COLLECTION CO:COLLECTION_SUMMARY All mice were housed in a pathogen-free facility and maintained on a 12-h light CO:COLLECTION_SUMMARY and 12-h dark cycle with free access to normal chow diet and water. CANA was CO:COLLECTION_SUMMARY mixed at 0.03% (w/w) with CRF-1 and administered to 8-week-old db/+ and db/db CO:COLLECTION_SUMMARY mice for 4 weeks. Food intake was calculated for 3 consecutive days each week CO:COLLECTION_SUMMARY using the mouse feeder MF-4S. At the end of the experiments, 6 h-fasted mice CO:COLLECTION_SUMMARY were anesthetized with isoflurane and blood samples were obtained from the CO:COLLECTION_SUMMARY inferior vena cava. Skeletal muscles including soleus and extensor digitorum CO:COLLECTION_SUMMARY longus were immediately frozen and stored at -80°C for metabolome and lipidome CO:COLLECTION_SUMMARY analysis. CO:SAMPLE_TYPE Skeletal muscles #TREATMENT TR:TREATMENT_SUMMARY All mice were free access to normal chow diet and water. CANA was mixed at 0.03% TR:TREATMENT_SUMMARY (w/w) with CRF-1 and administered to 8-week-old db/+ and db/db mice for 4 weeks. #SAMPLEPREP SP:SAMPLEPREP_SUMMARY Metabolites were extracted from frozen and crushed skeletal muscle (~10 mg) or SP:SAMPLEPREP_SUMMARY serum (20 uL) with 1 mL of solvent mixture (methanol:chloroform:water = 10:4:4, SP:SAMPLEPREP_SUMMARY v/v/v) containing piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES) (0.63 SP:SAMPLEPREP_SUMMARY umol/L), 2-bromohypoxanthine (0.13 umol/L), free fatty acid (FA) 16:0 (13C16) SP:SAMPLEPREP_SUMMARY (0.13 umol/L), diacylglycerol (DG) 15:0-18:1 (d7) (0.15 umol/L), and SP:SAMPLEPREP_SUMMARY triacylglycerol (TG) 15:0-18:1 (d7) -15:0 (0.35 umol/L) as internal standards. SP:SAMPLEPREP_SUMMARY The samples were vigorously mixed for 1 min and sonicated for 5 min. The SP:SAMPLEPREP_SUMMARY extracts were then centrifuged at 16,000 × g for 5 min at 4°C, and the SP:SAMPLEPREP_SUMMARY resultant supernatant was collected. Protein concentrations in the pellets were SP:SAMPLEPREP_SUMMARY determined using a Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, SP:SAMPLEPREP_SUMMARY Massachusetts, USA). The collected supernatant (700 uL) was mixed with 235 uL of SP:SAMPLEPREP_SUMMARY chloroform, and 155 uL of water, and then centrifuged at 16,000 × g for 5 min SP:SAMPLEPREP_SUMMARY at 4°C. The aqueous (upper) layer (400 µL) was evaporated under vacuum, dried SP:SAMPLEPREP_SUMMARY extracts were stored at −80°C until targeted polar metablome analysis. Prior SP:SAMPLEPREP_SUMMARY to analysis, the dried aqueous layer was reconstituted in 50 uL of water. The SP:SAMPLEPREP_SUMMARY organic (lower) layer (200 µL) was dried under a nitrogen stream, dried SP:SAMPLEPREP_SUMMARY extracts were stored at −80°C until targeted lipidome analysis. Prior to SP:SAMPLEPREP_SUMMARY analysis, the organic aqueous layer was reconstituted in 80 µL of SP:SAMPLEPREP_SUMMARY methanol/chloroform (1/1, v/v) #CHROMATOGRAPHY CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY Fatty acids (FA), diacylglycerols (DG), and triacylglycerols (TG) were analyzed CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY via Normal phase SFC/MS/MS. CH:INSTRUMENT_NAME Shimadzu Nexera UC CH:COLUMN_NAME Waters ACQUITY UPC2 Torus DEA (100 x 3.0mm, 1.7um) CH:COLUMN_TEMPERATURE 50℃ CH:FLOW_GRADIENT 0-1.0 min, 1%B, 1.0-24.0 min, 1-75%B, 24.0-26.0 min, 75%B, 26.0-26.1 min, CH:FLOW_GRADIENT 75-1%B, 26.1-30.0 min, 1%B CH:FLOW_RATE 1.0 mL/min CH:SOLVENT_A CO2 CH:SOLVENT_B 0.1% (w/v) ammonium acetate in MeOH/H2O (95/5) CH:CHROMATOGRAPHY_TYPE Normal phase CH:SOLVENT_C 0.1% (w/v) ammonium acetate in MeOH/H2O (95/5) #ANALYSIS AN:ANALYSIS_TYPE MS #MS MS:INSTRUMENT_NAME Shimadzu LCMS-8060 MS:INSTRUMENT_TYPE Triple quadrupole MS:MS_TYPE ESI MS:MS_COMMENTS MS acquisition: MRM mode (posi/nega) Data processing/software: MS:MS_COMMENTS Multi-ChromatoAnalyst (mCAT) ver.23 MS:ION_MODE UNSPECIFIED #MS_METABOLITE_DATA MS_METABOLITE_DATA:UNITS concentration (pmol/mg-protein) MS_METABOLITE_DATA_START Samples 13 14 15 16 61 62 63 64 10 11 12 57 58 59 60 9 21 22 23 24 5 6 7 8 1 17 18 19 2 20 3 4 49 50 51 52 Factors Animal:db/db | Treatment:Cana Animal:db/db | Treatment:Cana Animal:db/db | Treatment:Cana Animal:db/db | Treatment:Cana Animal:db/db | Treatment:Cana Animal:db/db | Treatment:Cana Animal:db/db | Treatment:Cana Animal:db/db | Treatment:Cana Animal:db/db | Treatment:vehicle Animal:db/db | Treatment:vehicle Animal:db/db | Treatment:vehicle Animal:db/db | Treatment:vehicle Animal:db/db | Treatment:vehicle Animal:db/db | Treatment:vehicle Animal:db/db | Treatment:vehicle Animal:db/db | Treatment:vehicle Animal:db/+ | Treatment:Cana Animal:db/+ | Treatment:Cana Animal:db/+ | Treatment:Cana Animal:db/+ | Treatment:Cana Animal:db/+ | Treatment:Cana Animal:db/+ | Treatment:Cana Animal:db/+ | Treatment:Cana Animal:db/+ | Treatment:Cana Animal:db/+ | Treatment:vehicle Animal:db/+ | Treatment:vehicle Animal:db/+ | Treatment:vehicle Animal:db/+ | Treatment:vehicle Animal:db/+ | Treatment:vehicle Animal:db/+ | Treatment:vehicle Animal:db/+ | Treatment:vehicle Animal:db/+ | Treatment:vehicle Animal:db/+ | Treatment:vehicle Animal:db/+ | Treatment:vehicle Animal:db/+ | Treatment:vehicle Animal:db/+ | Treatment:vehicle DG 16:0_16:0 105.4000 124.8000 53.5000 130.6000 15.5000 16.5000 15.1000 15.6000 52.4000 87.5000 40.7000 15.2000 9.1000 13.9000 10.7000 62.4000 61.5000 88.7000 83.4000 45.2000 59.8000 52.5000 62.5000 71.4000 27.4000 97.6000 99.3000 82.5000 22.1000 73.0000 26.8000 37.8000 6.4000 13.5000 5.7000 5.8000 DG 16:0_18:0 24.2000 21.8000 13.1000 24.5000 16.0000 17.8000 18.7000 19.1000 31.1000 38.4000 22.7000 17.3000 14.4000 21.5000 18.8000 31.7000 23.6000 33.6000 26.5000 19.3000 30.7000 30.1000 36.5000 33.0000 16.9000 26.3000 33.6000 22.5000 13.9000 21.5000 13.5000 18.2000 12.6000 18.2000 5.4000 7.3000 DG 16:0_18:1 195.6000 180.8000 132.0000 202.9000 103.1000 77.3000 107.6000 53.1000 390.6000 624.1000 318.7000 119.5000 76.3000 166.8000 75.6000 607.5000 319.8000 491.5000 323.1000 255.4000 418.4000 460.0000 541.3000 590.5000 249.5000 348.8000 486.6000 274.4000 202.1000 281.9000 180.3000 276.5000 71.5000 156.3000 27.6000 43.0000 DG 16:0_18:2 141.2000 145.8000 82.1000 147.4000 140.9000 126.8000 173.9000 94.7000 394.7000 681.1000 356.6000 105.2000 58.4000 105.5000 86.5000 572.2000 284.6000 620.7000 283.8000 187.3000 421.8000 363.4000 441.6000 469.3000 276.5000 272.9000 486.6000 150.3000 232.9000 170.6000 126.8000 290.2000 142.5000 300.9000 62.9000 83.3000 DG 16:0_20:4 4.6000 4.6000 2.8000 5.4000 2.0000 2.5000 2.2000 2.8000 6.9000 6.5000 3.6000 2.2000 5.7000 4.2000 8.7000 4.7000 3.4000 3.7000 3.6000 5.3000 4.8000 3.2000 3.7000 5.9000 4.0000 2.7000 3.4000 2.5000 3.6000 0.8000 0.8000 DG 16:0_20:5 2.3000 2.3000 1.0000 3.3000 4.0000 6.5000 5.8000 5.0000 2.5000 2.6000 1.3000 9.0000 5.4000 7.0000 7.0000 1.7000 1.4000 2.6000 2.2000 1.5000 3.3000 2.5000 4.4000 3.8000 1.6000 3.3000 3.6000 2.9000 1.3000 2.8000 0.8000 1.9000 4.2000 7.3000 1.8000 2.1000 DG 16:0_22:5 16.0000 17.5000 4.4000 18.1000 1.7000 2.3000 9.7000 11.0000 4.6000 1.6000 0.8000 7.4000 6.5000 10.0000 10.0000 6.3000 8.0000 8.0000 11.4000 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