#METABOLOMICS WORKBENCH tbelkin_20240826_181411 DATATRACK_ID:5149 STUDY_ID:ST003472 ANALYSIS_ID:AN005707 PROJECT_ID:PR002131 VERSION 1 CREATED_ON 12-06-2024 #PROJECT PR:PROJECT_TITLE Lipidomic profiling of heart and plasma of male and female DCM mice PR:PROJECT_SUMMARY Ventricles and plasma of male and female Ntg and dilated cardiomyopathy (DCM) PR:PROJECT_SUMMARY mice subjected to chow or alkylglycerol supplementation (1.5% of total chow) PR:PROJECT_SUMMARY from 10 weeks of age to 26 weeks of age (supplementation for 16 weeks). Males: PR:PROJECT_SUMMARY Ntg Chow n=7, Ntg Diet n=7, DCM Chow n=8, DCM Diet n=12. Females: Ntg Chow n=11, PR:PROJECT_SUMMARY Ntg Diet n=11, DCM Chow n=8, DCM Diet n=7 were subjected to lipidomic profiling. PR:INSTITUTE Baker Heart and Diabetes Institute PR:DEPARTMENT Discovery and Preclinical Science PR:LABORATORY Cardiac Hypertrophy PR:LAST_NAME Belkin PR:FIRST_NAME Teleah PR:ADDRESS 75 Commercial Road, Melbourne, Victoria, 3004, Australia PR:EMAIL teleah.belkin@baker.edu.au PR:PHONE +65385321266 PR:PUBLICATIONS https://doi.org/10.1016/j.jmccpl.2024.100273 PR:DOI http://dx.doi.org/10.21228/M85G08 #STUDY ST:STUDY_TITLE An optimized plasmalogen modulating dietary supplement provides greater ST:STUDY_TITLE protection in a male than female mouse model of dilated cardiomyopathy ST:STUDY_SUMMARY We previously reported that plasmalogens, a class of phospholipids, were ST:STUDY_SUMMARY decreased in a setting of dilated cardiomyopathy (DCM). Plasmalogen levels can ST:STUDY_SUMMARY be modulated via a dietary supplement called alkylglycerols (AG) which has ST:STUDY_SUMMARY demonstrated benefits in some disease settings. However, its therapeutic ST:STUDY_SUMMARY potential in DCM remained unknown. To determine whether an optimized AG ST:STUDY_SUMMARY supplement could restore plasmalogen levels and attenuate cardiac ST:STUDY_SUMMARY dysfunction/pathology, we placed a cardiac-specific transgenic DCM mouse model ST:STUDY_SUMMARY of both sexes on chow +/- 1.5% AG supplementation at ~10 weeks of age for 16 ST:STUDY_SUMMARY weeks. Cardiac function was assessed by echocardiography, tissues were collected ST:STUDY_SUMMARY for histological and molecular analyses including lipidomics and proteomics via ST:STUDY_SUMMARY liquid chromatography-mass spectrometry. AG supplementation increased total ST:STUDY_SUMMARY plasmalogens in DCM hearts and attenuated lung congestion of both sexes, but ST:STUDY_SUMMARY only prevented cardiac dysfunction in males. This was associated with attenuated ST:STUDY_SUMMARY cardiac and renal enlargement, a more favorable pro-cardiac gene expression ST:STUDY_SUMMARY profile, and a trend for lower cardiac fibrosis. By lipidomics, specific d18:1 ST:STUDY_SUMMARY ceramide species associated with cardiac pathology were lower in the DCM hearts ST:STUDY_SUMMARY from mice on the AG diet, and tetra-linoleoyl cardiolipin, a lipid crucial for ST:STUDY_SUMMARY mitochondria function was restored with AG supplementation. Proteomic analysis ST:STUDY_SUMMARY of hearts from male DCM mice receiving AG supplementation revealed enrichment in ST:STUDY_SUMMARY mitochondrial protein network, as well as upregulation of extracellular matrix ST:STUDY_SUMMARY binding proteins including agrin, a protein associated with cardiac ST:STUDY_SUMMARY regeneration. In summary, AG supplementation restored plasmalogens in DCM ST:STUDY_SUMMARY hearts, but showed greater therapeutic potential in males than females. ST:INSTITUTE Baker Heart and Diabetes Institute ST:DEPARTMENT Discovery and Preclinical Science ST:LABORATORY Cardiac Hypertrophy ST:LAST_NAME Belkin ST:FIRST_NAME Teleah ST:ADDRESS 75 Commercial Road, Melbourne, Victoria, 3004, Australia ST:EMAIL teleah.belkin@baker.edu.au ST:PHONE +65385321266 ST:SUBMIT_DATE 2024-08-26 #SUBJECT SU:SUBJECT_TYPE Mammal SU:SUBJECT_SPECIES Mus musculus SU:TAXONOMY_ID 10090 SU:GENOTYPE_STRAIN C57BL6 SU:AGE_OR_AGE_RANGE 26 weeks SU:GENDER Male and female SU:ANIMAL_LIGHT_CYCLE 12-hour light-dark cycle environment (6am-6pm) SU:ANIMAL_FEED Specialty Feeds Irradiated Rat and Mouse Standard Chow Diet or 1.5% SU:ANIMAL_FEED alkylglycerols per 100g of chow SU:SPECIES_GROUP Mammals #SUBJECT_SAMPLE_FACTORS: SUBJECT(optional)[tab]SAMPLE[tab]FACTORS(NAME:VALUE pairs separated by |)[tab]Additional sample data SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 38708_Plasma Sex:Female | Genotype:DCM | Diet:Chow | Sample source:Plasma RAW_FILE_NAME(Raw file name)=MP23-027_01-013_S_E01-V012_P3.d SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 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39017_Vent Sex:Male | Genotype:Ntg | Diet:Diet | Sample source:Ventricle RAW_FILE_NAME(Raw file name)=MP22-029_01-015_S_E01-V007_V45.d SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 39019_Vent Sex:Male | Genotype:Ntg | Diet:Diet | Sample source:Ventricle RAW_FILE_NAME(Raw file name)=MP22-029_01-057_S_E01-V046_V47.d #COLLECTION CO:COLLECTION_SUMMARY Ventricles were dissected from mice. Tissues were snap frozen in liquid nitrogen CO:COLLECTION_SUMMARY and stored in -80 freezer until tissues were processed for lipid extractions CO:COLLECTION_SUMMARY Blood was collected via cardiac puncture and stored in EDTA tubes on ice. EDTA CO:COLLECTION_SUMMARY tubes were spun at 3000g for 15 mins at 4 degrees. Plasma was then collected CO:COLLECTION_SUMMARY from these tubes (supernatant) and then stored at -80 degrees. CO:SAMPLE_TYPE Heart CO:STORAGE_CONDITIONS -80â CO:COLLECTION_VIALS 1.5mL Eppendorf tubes CO:STORAGE_VIALS 1.5mL Eppendorf tubes #TREATMENT TR:TREATMENT_SUMMARY 10-week-old Ntg and DCM mice were placed on chow or 1.5% AG supplementation for TR:TREATMENT_SUMMARY 16 weeks. Mice were fasted for 6 hours before dissections, and a lethal dose of TR:TREATMENT_SUMMARY anesthesia was delivered via intraperitoneal injection before tissue collection. TR:TREATMENT Dietary supplementation TR:TREATMENT_COMPOUND Alkylglycerols TR:TREATMENT_DOSE 1.5% alkylglycerols per 100g of chow TR:TREATMENT_DOSEDURATION 16 weeks TR:TREATMENT_VEHICLE Chow TR:ANIMAL_ANESTHESIA Sodium pentobarbitone TR:ANIMAL_FASTING 6 hours #SAMPLEPREP SP:SAMPLEPREP_SUMMARY Ventricles were homogenised in 1xPBS and then sonicated with a probe-sonicator SP:SAMPLEPREP_SUMMARY for 15 seconds, 23 amplitude. BCA assays were then conducted to determine SP:SAMPLEPREP_SUMMARY protein concentrations of these homogenates. Lipid extraction was conducted SP:SAMPLEPREP_SUMMARY using 10ul of sample (ventricle, 5mg/ml) using the single-phase chloroform SP:SAMPLEPREP_SUMMARY methanol method. 10ul of internal standards and 200ul of chloroform:methanol SP:SAMPLEPREP_SUMMARY (1:2) were added to samples before the mixture was vortexed. Samples were then SP:SAMPLEPREP_SUMMARY placed on a rotary shaker for 10 mins at a speed of 90 before being transferred SP:SAMPLEPREP_SUMMARY to a bath sonicator. Samples were then sonicated for 30 mins at water SP:SAMPLEPREP_SUMMARY temperature below 28 degrees. Samples were then removed and rested at room SP:SAMPLEPREP_SUMMARY temperature for 20 mins. Samples were then centrifuged at 13000rpm for 10 SP:SAMPLEPREP_SUMMARY minutes. 200ul of the supernatant was then transferred to 0.5ml polypropylene 96 SP:SAMPLEPREP_SUMMARY well plates and spun dried using a speedvac vacuum concentrator. Lipids were SP:SAMPLEPREP_SUMMARY reconstituted in 50ul water saturated butanol + 50ul of Ammonium Formate. SP:SAMPLEPREP_PROTOCOL_FILENAME Agilent_Protocol SP:PROCESSING_STORAGE_CONDITIONS -80â SP:EXTRACTION_METHOD Chloroform:Methanol #CHROMATOGRAPHY CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY The running solvent consisted of solvent A: 50% H2O / 30% acetonitrile / 20% CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY isopropanol (v/v/v) containing 10mM ammonium formate and 5uM medronic acid, and CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY solvent B: 1% H2O / 9% acetonitrile / 90% isopropanol (v/v/v) containing 10mM CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY ammonium formate. We utilized a stepped linear gradient with a 16-minute cycle CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY time per sample and a 1µL sample injection. To increase throughput, we used a CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY dual column set up to equilibrate the second column while the first is running a CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY sample. The sample analytical gradient was as follows: starting with a flow rate CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY of 0.4mL/minute at 15% B and increasing to 50% B over 2.5 minutes, then to 57% CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY over 0.1 minutes, to 70% over 6.4 minutes, to 93% over 0.1 minute, to 96% over CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY 1.9 minutes and finally to 100% over 0.1 minute. The solvent was then held at CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY 100% B for 0.9 minutes (total 12.0 minutes). Equilibration was started as CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY follows: solvent was decreased from 100% B to 15% B over 0.2 minutes and held CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY until a total of 16 minutes. The next sample is injected and the columns are CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY switched. CH:INSTRUMENT_NAME Agilent 1290 Infinity II CH:COLUMN_NAME Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (100 x 2.1mm,1.8um) CH:COLUMN_TEMPERATURE 45â CH:FLOW_GRADIENT starting with a flow rate of 0.4mL/minute at 15% B and increasing to 50% B over CH:FLOW_GRADIENT 2.5 minutes, then to 57% over 0.1 minutes, to 70% over 6.4 minutes, to 93% over CH:FLOW_GRADIENT 0.1 minute, to 96% over 1.9 minutes and finally to 100% over 0.1 minute. The CH:FLOW_GRADIENT solvent was then held at 100% B for 0.9 minutes (total 12.0 minutes). CH:FLOW_GRADIENT Equilibration was started as follows: solvent was decreased from 100% B to 15% B CH:FLOW_GRADIENT over 0.2 minutes and held until a total of 16 minutes. CH:FLOW_RATE 0.4 mL/min CH:SOLVENT_A 50% water/30% acetonitrile/20% isopropanol; 10mM ammonium formate; 5uM medronic CH:SOLVENT_A acid CH:SOLVENT_B 1% water/9% acetonitrile/90% isopropanol; 10mM ammonium formate CH:CHROMATOGRAPHY_TYPE Reversed phase #ANALYSIS AN:ANALYSIS_TYPE MS AN:ANALYSIS_PROTOCOL_FILE Agilent_Protocol.pdf #MS MS:INSTRUMENT_NAME Agilent 6490 QQQ MS:INSTRUMENT_TYPE Triple quadrupole MS:MS_TYPE ESI MS:MS_COMMENTS Analysis of ventricles and plasma extracts was performed on an Agilent 6490 QQQ MS:MS_COMMENTS mass spectrometer with an Agilent 1290 series HPLC system and a ZORBAX eclipse MS:MS_COMMENTS plus C18 column (2.1x100mm 1.8μm, Agilent) with the thermostat set at 60°C. MS:MS_COMMENTS Mass spectrometry analysis was performed in positive ion mode with dynamic MS:MS_COMMENTS scheduled multiple reaction monitoring (MRM). The following mass spectrometer MS:MS_COMMENTS conditions were used; gas temperature, 150°C, gas flow rate 17L/min, nebulizer MS:MS_COMMENTS 20psi, Sheath gas temperature 200°C, capillary voltage 3500V and sheath gas MS:MS_COMMENTS flow 10L/min. Isolation widths for Q1 and Q3 were set to âunitâ resolution MS:MS_COMMENTS (0.7 amu). MS:ION_MODE POSITIVE #MS_METABOLITE_DATA MS_METABOLITE_DATA:UNITS pmol per umol PC (ventricle) pmol per ml (plasma) MS_METABOLITE_DATA_START Samples 38708_Plasma 38736_Plasma 38738_Plasma 39013_Plasma 39371_Plasma 39372_Plasma 39374_Plasma 39382_Plasma 38708_Vent 38736_Vent 38738_Vent 39013_Vent 39371_Vent 39372_Vent 39374_Vent 39382_Vent 38719_Plasma 38730_Plasma 39010_Plasma 39375_Plasma 39376_Plasma 39380_Plasma 39384_Plasma 38719_Vent 38730_Vent 39010_Vent 39375_Vent 39376_Vent 39380_Vent 39384_Vent 38707_Plasma 38715_Plasma 38716_Plasma 38737_Plasma 39014_Plasma 39022_Plasma 39023_Plasma 39370_Plasma 39373_Plasma 39381_Plasma 39383_Plasma 38707_Vent 38715_Vent 38716_Vent 38737_Vent 39014_Vent 39022_Vent 39023_Vent 39370_Vent 39373_Vent 39381_Vent 39383_Vent 38706_Plasma 38725_Plasma 38728_Plasma 38729_Plasma 39011_Plasma 39012_Plasma 39025_Plasma 39377_Plasma 39378_Plasma 39379_Plasma 39385_Plasma 38706_Vent 38725_Vent 38728_Vent 38729_Vent 39011_Vent 39012_Vent 39025_Vent 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